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抗體選擇-開啟流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

來源:美天旎 | 作者:muchenbio | 發(fā)布時(shí)間: 2024-02-21 | 777 次瀏覽 | 分享到:

抗體作為細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)中最重要的試劑之一，科學(xué)界每年在這類試劑上的花費(fèi)約達(dá)20億美元^[^1]。但是我們經(jīng)常會(huì)聽到一些令人沮喪的結(jié)果---抗體不起作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法重復(fù)。

抗體的不可靠性給生物學(xué)研究（包括癌癥，代謝，免疫學(xué)等）帶來巨大的損失，尤其是流式實(shí)驗(yàn)過程，抗體的選擇極其重要，可重復(fù)性差，特異性不足，批間差異性等均可導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果和大量時(shí)間的浪費(fèi)。但近年來，生物界對實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性越來越關(guān)注，傳統(tǒng)抗體存在的問題凸顯出來：

每使用一管新抗體都需要進(jìn)行滴定測試，做不好還浪費(fèi)抗體；
那么多種同型對照，是人是鼠傻傻分不清楚；
步驟復(fù)雜，一旦忘記加 Fc 阻斷試劑，一切從頭來過；
抗體不佳，陽性細(xì)胞群不明顯，但樣品珍貴，實(shí)驗(yàn)就地?cái)R置；
……

2015年2月份，瑞士蘇黎世大學(xué)（University of Zurich）蛋白質(zhì)工程學(xué)家Andrew Bradbury，Andreas Plückthun和來自世界各地的110名研究人員在Nature上共同倡議：抗體的生產(chǎn)應(yīng)該標(biāo)準(zhǔn)化^[^2]。像基因一樣，抗體也應(yīng)由它們的序列來定義，并且應(yīng)該在細(xì)胞系中重組而成，而非通過動(dòng)物免疫得到，這樣才能保證抗體的標(biāo)準(zhǔn)化及實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。有科學(xué)家提出：使用重組抗體^[^1]。

重組抗體不同于傳統(tǒng)抗體，無需通過動(dòng)物源性的樣本制備，由改造后的抗體基因序列直接在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞培養(yǎng)均在標(biāo)準(zhǔn)化，無血清的環(huán)境中進(jìn)行?？贵w的生產(chǎn)均在遺傳背景完全相同的細(xì)胞系中表達(dá)，極大避免了表達(dá)系統(tǒng)不同而帶來的抗體批次間質(zhì)量差異性。

美天旎 REAfinity^TM 重組抗體——為流式而生

什么是 REAfinity 抗體？
REAfinity 抗體是一種重組基因工程改造抗體，是將傳統(tǒng)的小鼠或大鼠雜交瘤來源的單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)（Fab）與經(jīng)過突變的人 IgG1 的恒定區(qū)（Fc）進(jìn)行基因重組而成。

為什么說 REAfinity抗體是為流式而生？

1）批次間穩(wěn)定一致

REAfinity重組抗體源于一段只編碼一種重鏈和輕鏈的DNA序列，從而確?？贵w的超高純度。標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)條件下，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，保證了抗體質(zhì)量的批次間穩(wěn)定性。

圖2：對抗體進(jìn)行質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)表明：REAfinity抗體純度非常高，而雜交瘤來源的抗體是一種混合物。(A)對兩個(gè)雜交瘤來源的單克隆抗體樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析，可以看出，它們都含有一條分子量接近23,635Da的污染輕鏈。(B)兩個(gè)REAfinity抗體樣本的質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，其含有極高純度的輕鏈。

2）通用型同型對照

所有的REAfinity抗體都是人IgG1亞型；因此，對于超過1萬種REA克隆號的所有抗體來說，只需一種人IgG1同型對照。根據(jù)抗原表達(dá)位置不同，該通用型同型對照抗體分為膜表面型和胞內(nèi)型兩類，無需花費(fèi)時(shí)間尋找合適的同型對照抗體。

圖3：使用REAfinity抗體時(shí)，只需一種通用型同型對照，降低了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的復(fù)雜程度

3）無需Fc受體阻斷

REAfinity抗體Fc段經(jīng)基因突變改造，從而消除了抗體與Fcγ受體的非特異性結(jié)合。因此，在流式分析中，無需額外增加阻斷步驟。

4）優(yōu)選序列，染色指數(shù)高

挑選最佳克隆號的抗體，以該抗體序列作為改造的基礎(chǔ)，所以REAfinity抗體親和力更高、特異性更好；REAfinity抗體本身背景值低、抗體與熒光素結(jié)合的優(yōu)良工藝，二者保證了抗體的高染色指數(shù)。

參考文獻(xiàn)：
[1]Goodman SL. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. N Biotechnol. 2018 Oct 25;45:9-13. doi: 10.1016/j.nbt.2018.01.006. Epub 2018 Feb 3. PMID: 29355666.
[2]Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature 518, 27–29 (2015). https://doi.org/10.1038/518027a.